Comment extraire l'ADN des champignons de la rouille colonisés sur la matière végétale?
Ceci décrit une procédure pour extraire l'ADN des champignons des espèces de rouille colonisés sur n'importe quelle matière végétale.
Ceci décrit une procédure pour extraire l'ADN des champignons des espèces de rouille colonisés sur n'importe quelle matière végétale. Le produit final est un mélange d'ADN principalement fongique et d'une petite quantité d'ADN végétal dans une solution qui peut être utilisée dans l'amplification PCR. Une expérience préalable en laboratoire humide est attendue. Adapté du protocole du fabricant.
- 1Ajouter aux tubes de matrice de lyse C 25-25 mg de tissu foliaire infecté (taille d'une punaise) et 20-25 mg de terre de diatomées (une cuillère de cure-dent)
- 2Placer les échantillons dans l'homogénéisateur MP fastprep 24 pendant 20 secondes à la vitesse 4.
- 3Ajouter 600μl de tampon de lyse génomique avec de la protéinase K. Rapidement, vortexer pour mélanger complètement.
- 4Incuber à 60°C pendant 1 heure. Retourner toutes les 15 minutes pour mélanger.
- 5Laisser refroidir à température ambiante.
- 6Ajouter 200μl de chloroforme. Inverser pour mélanger.
- 7Essorez à vitesse maximale pendant 10 minutes.
- 8Transférer le surnageant (couche supérieure) dans un tube propre de 1,5 ml. Jeter le tube précédent.
- 9Ajouter 50 μl de solution de décapage d'ADN. Inverser pour mélanger.
- 10Incuber à 60°C pendant 1 heure.
- 11Rapidement, placez sur de la glace pendant 5 minutes.
- 12Ajouter 100μl de solution de précipitation. Inverser pour mélanger. Si aucun précipité blanc ne se forme, ajouter un ajout de 50μL
- 13Essorez à vitesse maximale pendant 5 minutes.
- 14Sans déranger le culot, transférer le surnageant dans un tube propre de 1,5 ml. Jeter le tube précédent.
Si le culot n'entre pas tout seul en solution, incuber 5 minutes à 37°C. - 15Ajouter 5μl de glycogène de moule et 500μl d'isopropanol.
- 16Retourner au moins 50 fois pour mélanger.
- 17Essorez à vitesse maximale pendant 10 minutes. Vous voudrez peut-être disposer les tubes dans le même sens, de sorte que le culot soit toujours du même côté après centrifugation.
- 18Il devrait y avoir une petite pastille au fond. Videz le surnageant en faisant très très attention à ne pas déloger le culot d'ADN. S'il n'y a pas de culot, vous devez réessayer l'extraction.
- 19Ajouter 100μl de tampon TE au culot. Si le culot n'entre pas tout seul en solution, incuber 5 minutes à 37°C.
- 20L'extraction d'ADN est terminée. Vous pouvez évaluer la qualité/quantité de l'ADN sur un gel d'agarose.
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