Comment effectuer une extraction chromosomique bactérienne?
Ajouter 400 ul de phénol: chloroforme (dangereux) puis inverser la solution pendant 2 minutes.
Extraction chromosomique bactérien est effectuée dans le but d'isoler et de purifier le génome de la bactérie pour une étude plus approfondie. Cet ADN isolé peut ensuite être utilisé pour d'autres expériences standard telles que la PCR, le séquençage à haut débit et autres. L'importance de l'isolement du génome ne peut pas être sous-estimée, donc une bonne et indulgente procédure pour l'extraction de l'ADN bactérien améliorera les résultats de laboratoire. La méthode est utilisée si souvent que les membres les plus expérimentés du laboratoire mémoriseront toutes les étapes.
Partie 1 sur 2: premier jour
- 1Cultivez les cellules bactériennes en phase stationnaire dans une solution de croissance (2,0 ml) pendant la nuit dans un agitateur de laboratoire (agitateur). Faire incuber les cellules à 37°C avec l'agitateur.
Partie 2 sur 2: jour deux
- 1Centrifuger 1,5 ml de solutions cellulaires pendant 3 minutes à 5700 rpm.
- 2Pipeter les 1,5 ml de surnageant après centrifugation en ne laissant que le culot au fond du tube.
- 3Re-suspendre le culot dans 360 ul de solution saline-edta
- 4Ajouter 40 ul de lysozyme à la solution et incuber à 37°C dans un bain d'eau chaude pendant 35 minutes.
- 5Ajouter 400 ul de phénol (dangereux) puis inverser la solution pendant 2 minutes.
- 6Centrifuger 5 minutes à vitesse maximale.
- 7Pipetez la couche organique de phénol (dangereux) (environ 400 ul) de la solution.
- 8Ajouter 400 ul de phénol: chloroforme (dangereux) puis inverser la solution pendant 2 minutes.
- 9Centrifuger 5 minutes à vitesse max.
- 10Pipeter la couche organique de phénol: chloroforme (dangereux) (environ 400 uL) de la solution.
- 11Ajouter 400 ul de chloroforme (dangereux) puis inverser la solution pendant 2 minutes.
- 12Centrifuger 5 minutes à vitesse max.
- 13Pipeter la couche organique de chloroforme (dangereux) (environ 400 ul) de la solution. Jetez soigneusement tous les déchets de phénol et de chloroforme dans un conteneur séparé pour les déchets dangereux.
Pipeter la couche organique de phénol (dangereux) (environ 400 ul) de la solution. - 14Ajouter 800 ul de 100% etoh à la couche aqueuse et inverser à plusieurs reprises (devrait voir précipitation de l'ADN).
- 15Conserver au congélateur à -20°C pendant 30 minutes pour augmenter la précipitation de l'ADN.
- 16Centrifuger pendant 15 minutes à vitesse maximale et pipeter la couche aqueuse jusqu'à ce qu'il ne reste que le culot au fond du tube.
- 17Re-suspendre le culot en ajoutant 300-ul de 70% etoh puis centrifuger pendant 5 minutes à vitesse maximale.
- 18Pipeter la couche aqueuse jusqu'à ce qu'il ne reste que le culot, puis remettre le culot en suspension dans 200 ul d'eau.
- 19Flick le tube à plusieurs reprises pour suspendre le culot dans l'eau. Assurez-vous de ne pas vortexer car cela endommagerait l'ADN!
- 20Conserver à 4°C.
- Problèmes de sécurité: Le phénol et le chloroforme sont tous deux des produits chimiques très nocifs qui endommagent la peau en cas de contact. Soyez prudent en manipulant les deux. Éliminer les déchets des étapes impliquant du phénol et du chloroforme dans un conteneur de déchets de phénol et de chloroforme.
- Les gants sont fortement recommandés lors de l'utilisation de ces produits chimiques. Ne pas ingérer aucun de ces produits chimiques soit.
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