Comment effectuer une transformation de levure?
Vous devriez également déjà avoir des cellules de levure en croissance sur une plaque avec un extrait de levure-peptone-adénine-dextrose ou un milieu similaire.
La levure, un organisme eucaryote unicellulaire, est plus complexe et applicable aux humains que les bactéries, mais se développe plus rapidement et nécessite moins d'entretien qu'un modèle animal multicellulaire. La transformation de levure est l'une des techniques les plus fréquemment utilisées chez la levure. Semblable à la transformation bactérienne1, la transformation de levure est une méthode de base pour forcer les cellules de levure à prendre un plasmide (un morceau circulaire d'ADN artificiel contenant souvent un gène d'intérêt) et à se développer, produisant de nombreuses copies du plasmide.
- 1Avant de commencer votre transformation, assurez-vous d'abord d'avoir suffisamment de matériel, y compris: l'ADN plasmidique, l'ADN simple brin 2, tous les tampons (0,1 M de LiOAc et PEG3 fraîchement préparé) et les milieux (extrait de levure-peptone-adénine- Milieux liquides de dextrose et plaques avec milieux sélectifs). Les supports liquides et les plaques prendront le plus de temps à fabriquer si vous êtes absent.
- 2La veille au soir (ou en fin d'après-midi), faites des cultures liquides des cellules de levure que vous allez transformer.
- 3Vous devriez également déjà avoir des cellules de levure en croissance sur une plaque avec un extrait de levure-peptone-adénine-dextrose ou un milieu similaire.
- En travaillant près de la flamme, transférer 5 millilitres (0,17 fl oz) d'extrait de levure liquide-peptone-adénine-dextrosemédia dans un tube de culture avec une pipette sérologique.
- Grattez une petite quantité de cellules hors de la plaque avec une pointe de pipette, en prenant soin de ne pas percer le support solide.
- Abaissez délicatement l'embout dans le tube, en prenant soin de ne pas toucher les cellules à la paroi interne du tube.
- Pipetez le liquide de haut en bas jusqu'à ce que vous puissiez voir l'amas de cellules sur la pointe se dissoudre.
- Couvrir les tubes sans serrer pour assurer le flux d'oxygène vers les cellules.
- Incuber les tubes dans un agitateur à 30°C pendant la nuit.
- Retirer les cultures du shaker à 30°C de la veille et fermer hermétiquement les bouchons.
- Retirez l'ADN plasmidique et l'ADN simple brin du congélateur (ils sont normalement conservés à -20⁰C). Laisser décongeler l'ADN plasmidique à température ambiante. Chauffer l'ADN simple brin dans la plaque chauffante 95⁰C. La solution devrait devenir très chaude (presque bouillante) au moment où l'ADN simple brin est utilisé dans la procédure.
- 4Transformation de levure: Vous devriez maintenant être enfin prêt à commencer la procédure.
Pour la transformation de levure. - 5Temps estimé: minimum 2h.
- 6Réglez une plaque chauffante à 95⁰c (peut être entre 90⁰ et 97⁰) et une autre à 30⁰c.
- 7Allumez le bec Bunsen et n'oubliez pas de travailler le plus près possible de la flamme.
- 8Étiqueter les tubes Eppendorf propres. Les tubes sont normalement étiquetés avec le contenu (plasmide transformé), la date et les initiales du scientifique.
- 9Pipeter 600 ul de la culture liquide dans chaque tube eppendorf.
- 10Tubes à centrifuger pendant 2 min à 2000 rpm. Assurez-vous d'équilibrer la centrifugeuse uniformément.
- 11Retirer le surnageant par aspiration sous vide, en veillant à ne pas aspirer de cellules dans le culot.
- 12Re-suspendre le culot dans 300 ul de tampon lioac 0,1 M en pipetant ou en vortexant rapidement les tubes.
- 13Centrifuger à nouveau pendant 1 min à 2000 tr/min et aspirer le surnageant.
- 14Répétez les étapes 6 et 7 pour vous assurer que tous les supports sont éliminés des cellules.
- 15Pipeter 600 ul de tampon PEG dans chaque tube. Le PEG est une substance très visqueuse, soyez donc prudent lors du pipetage. Pipeter lentement, en regardant le tampon s'écouler de la pointe. Si vous pipetez trop rapidement, il restera encore du tampon PEG dans le tube.
- 16Pipeter 5 ul d'ADN plasmidique et 10 ul d'ADN simple brin chaud dans chaque tube.
La veille au soir (ou en fin d'après-midi), faites des cultures liquides des cellules de levure que vous allez transformer. - 17Incuber les tubes sur la plaque chauffante à 30ᵒ, de 30 minutes à toute la nuit.
- 18Choc thermiquement les tubes dans un bain-marie à 42ᵒ pendant 15 min EXACTEMENT.
- 19Centrifuger les tubes pendant 2 min à 3000 tr/min et aspirer soigneusement le surnageant.
- 20Re-suspendre le culot dans 100 ul d'eau MQ.
- 21Plaque chaque échantillon sur une plaque sélective séparée. Attention à la contamination à cette étape!
- Retirer les assiettes de la chambre froide, laisser réchauffer à température ambiante et étiqueter chacune.
- Utilisez un épandeur à cellules en acier inoxydable stérilisé, d'abord trempé dans de l'éthanol, puis passé à travers la flamme pour évaporer l'éthanol. Laissez refroidir l'épandeur.
- Touchez un coin d'un coin de l'épandeur au bord de la plaque. Si l'épandeur fait une entaille dans le média, le métal est encore trop chaud.
- 22Pipeter la suspension cellulaire de chaque tube eppendorf sur la plaque correspondante.
- 23Répartir les cellules uniformément avec un épandeur stérilisé à la main ou sur une plate-forme rotative.
- 24Séchez les assiettes autour de la flamme avec des couvercles pour la plupart, en laissant un petit espace ouvert le plus proche de la flamme. Ne laissez pas une trop grande partie de la plaque ouverte ou la contamination se produira plus facilement.
- 25Dès qu'elles sont sèches, couvrir les plaques et les sceller avec du parafilm.
- 26Incuber les plaques dans un incubateur de 30⁰. Les colonies devraient croître en 3 à 7 jours.
Semblable à la transformation bactérienne1, la transformation de levure est une méthode de base pour forcer les cellules de levure à prendre un plasmide (un morceau circulaire d'ADN artificiel contenant souvent un gène d'intérêt) et à se développer, produisant de nombreuses copies du plasmide.
- De loin, le plus grand obstacle à une transformation réussie de la levure est la contamination. Toute exposition excessive des cellules de levure à l'air libre peut permettre aux bactéries en suspension dans l'air de contaminer les cellules. Des jours de croissance peuvent s'écouler avant que la contamination ne soit visible (la contamination se manifeste généralement par des taches floues et décolorées sur les plaques de transformation), vous pouvez donc perdre des jours de travail à la fois chaque fois que votre transformation est contaminée. Lorsque vous travaillez avec des cellules de levure, restez toujours à proximité d'une flamme et minimisez autant que possible l'exposition à l'air!
- Pour les cultures liquides:
- Tubes de culture (un tube suffira pour environ 8 échantillons)
- Milieu liquide extrait de levure-peptone-adénine-dextrose
- Pour la transformation de levure:
- bec Bunsen et percuteur
- Cultures liquides
- Tubes Eppendorf (un pour chaque échantillon)
- Marqueur étanche pour l'étiquetage
- Pipette et pointes de 1000 uL
- Tampons: 0,1 M LiOAc, PEG
- ADN plasmidique
- ADN simple brin
- Plaques sélectives
- Éthanol
- Épandeur de cellules
- Parafilm
- Équipement:
- bec Bunsen et percuteur
- Centrifuger
- Vortex
- Vide
- Bain-marie 42⁰ et support de tube flottant
- Deux plaques chauffantes
- incubateur 30⁰
- Plate-forme à plateau tournant (en option)
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