Comment identifier les bactéries?

Les bactéries à Gram positif ont une paroi cellulaire très épaisse (faite d'un polymère appelé peptidoglycane) qui retient mieux une coloration de colorant que les parois cellulaires plus minces des bactéries à Gram négatif.

Dans la plupart des cas, l'identification des bactéries se fait par un processus d'élimination pour restreindre les choix jusqu'à ce que vous arriviez au bon. Le faire correctement est un processus incroyablement complexe, en partie parce qu'il y a tellement de types - certains scientifiques estiment que le nombre d'espèces de bactéries pourrait dépasser le milliard! Même avec autant de choix, l'identification est particulièrement importante dans les contextes cliniques et médicaux. Pour faciliter les choses, il existe des normes d'identification qui proviennent de l'utilisation de techniques de coloration pour examiner l'apparence de la bactérie et observer les réactions de la bactérie à différentes conditions.

Méthode 1 sur 4: identification des bactéries avec coloration Gram

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Utilisez la coloration de Gram pour voir si les bactéries sont à Gram positif ou à Gram négatif. La coloration de Gram est une procédure qui vous permet de diviser les bactéries en 2 types courants: Gram positif et Gram négatif. Les bactéries à Gram positif ont une paroi cellulaire très épaisse (faite d'un polymère appelé peptidoglycane) qui retient mieux une coloration de colorant que les parois cellulaires plus minces des bactéries à Gram négatif.
- Les genres communs de bactéries à Gram positif comprennent Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus et Listeria.
- Les genres communs de bactéries à Gram négatif comprennent Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter et Fusobacterium.
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Utilisez des précautions de sécurité. Les bactéries et produits chimiques que vous manipulerez lors d'une procédure de coloration de Gram sont tous potentiellement dangereux. Portez des lunettes, des gants jetables en nitrile et une blouse de laboratoire lors de la tâche. Mettez vos gants jetables et tout autre déchet contaminé dans un sac à risque biologique lorsque vous avez terminé. Suivez les procédures de votre laboratoire pour éliminer le sac de risque biologique.
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Faites une lame de votre échantillon bactérien. Pour commencer le processus, placez une petite goutte ou un morceau de votre échantillon bactérien sur une lame stérile. Passer la lame à travers la flamme d'un bec Bunsen 3 fois pour chauffer l'échantillon. Cela empêchera l'échantillon de se laver lorsque vous ajoutez des réactifs ou rincez la lame.
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Ajoutez 5 gouttes de cristal violet à la lame. Placez les gouttes de colorant cristal violet sur la culture fixée à la chaleur. Laissez l'échantillon tremper dans le colorant violet cristal pendant 1 minute.
- Pour éviter de tacher votre main, vous souhaiterez peut-être maintenir la glissière en place avec une épingle à linge.
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Rincez doucement la lame pour enlever la tache. Utilisez un jet d'eau très doux provenant d'un évier ou d'une bouteille à jet. Ne rincez pas pendant plus de 5 secondes. Ce processus supprimera tout colorant qui n'est pas lié à l'échantillon.
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Ajoutez 5 gouttes d'iode de gramme à la lame. L'iode de Gram est une solution d'iode, d'iodure de potassium et de bicarbonate de sodium. Cette solution provoquera la fusion du colorant cristal violet avec les parois cellulaires des bactéries. Ajouter environ 5 gouttes et laisser reposer 1 minute.
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Rincez l'échantillon avec de l'alcool ou de l'acétone. L'alcool et l'acétone sont des agents décolorants. Si vos bactéries sont une souche à Gram négatif, ces agents élimineront la tache des parois cellulaires bactériennes. Laisser quelques gouttes de l'agent décolorant couler sur l'échantillon et laisser reposer pendant 3 secondes au maximum. Rincer doucement à l'eau pendant 5 secondes maximum pour éliminer l'alcool ou l'acétone.
- Si vous laissez l'agent décolorant reposer sur l'échantillon trop longtemps, il peut éliminer la tache des bactéries Gram positives, provoquant un faux résultat Gram négatif.
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Contre-colorer la solution avec de la safranine. La safranine est un colorant rouge, qui agira comme un contre-colorant au cristal violet et teindra toutes les bactéries qui n'ont pas retenu la tache violette. Ajouter environ 5 gouttes de solution de safranine à l'échantillon et laisser reposer pendant 1 minute. Rincer très doucement à l'eau pendant 5 secondes.
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Visualisez votre échantillon au microscope à un grossissement de 1000x. Si la bactérie est une souche Gram positive, elle apparaîtra violette ou violette au microscope. Les bactéries à Gram négatif apparaîtront en rouge à partir du contre-colorant à la safranine.

Méthode 2 sur 4: Utilisation de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen

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Utilisez la coloration ziehl-neelsen pour détecter les bactéries acido-résistantes. Les bactéries acido-résistantes contiennent une plus grande quantité de lipides que les autres types de bactéries, ce qui les rend résistantes aux agents colorants utilisés dans la coloration de Gram. Les bactéries acido-résistantes appartiennent au genre Mycobacterium, qui comprend la bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis). Les bactéries acido-résistantes peuvent être colorées avec un colorant rouge carbol-fuchsine, qui résistera au rinçage avec une solution d'alcool acide ou d'acide sulfurique.
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Prenez les précautions de sécurité appropriées. Les produits chimiques et biologiques utilisés lors d'une procédure de coloration Ziehl-Neelsen peuvent être dangereux. Vous utiliserez également des sources de chaleur, telles qu'un brûleur Bunsen, une lampe à alcool ou un radiateur électrique. Prenez les précautions suivantes lors de l'exécution de cette procédure:
- Portez des lunettes, des gants en nitrile et une blouse de laboratoire.
- Veillez à ne pas inhaler les vapeurs des solutions de coloration et de décoloration, ni à les mettre sur votre peau ou dans vos yeux. Gardez tous les conteneurs ouverts sous une hotte.
- Faites très attention lorsque vous chauffez votre lame, car la plupart des produits chimiques que vous utiliserez sont inflammables. Il peut également y avoir des traces de produits chimiques inflammables sur les portoirs à lames et autres équipements.
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Préparez une diapositive. Étalez un frottis de votre échantillon uniformément sur le centre d'une lame stérile, en utilisant des mouvements circulaires. Votre frottis doit mesurer environ 10 mm (1 cm) sur 20 mm (2 cm).
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Séchez votre lame. Placez la lame sur une grille de séchage, frottis vers le haut. Laisser sécher à l'air pendant 30 minutes. N'essayez pas d'éponger la lame à sec.
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La chaleur corrige votre frottis. Vous pouvez chauffer l'échantillon en passant la lame sur la flamme d'un bec Bunsen 2 à 3 fois, côté frottis vers le haut. Vous pouvez également placer la lame sur un chauffe-lame électrique à 65° -75°C (149° -75°C) pendant au moins 2 heures. Veillez à ne pas brûler ou faire bouillir l'échantillon.
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Ajoutez une tache de carbol-fuchsine à votre lame. Mettez plusieurs gouttes de solution de carbol-fuchsine sur la lame. Ajoutez suffisamment pour couvrir complètement le frottis.
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Chauffez la lame tachée pour fixer la tache sur le frottis. Chauffez doucement la lame sur un brûleur Bunsen ou une lampe à alcool, côté enduit vers le haut, ou placez-la sur un radiateur électrique. Chauffer la lame jusqu'à ce qu'elle atteigne 60°C. Vous devriez voir la vapeur commencer à monter. Laissez la tache chauffée reposer sur la lame pendant 5 minutes.
- Si vous utilisez un chauffe-glissière électrique, réglez-le à 60°C. Si vous utilisez un bec Bunsen ou une lampe à alcool, vous devrez surveiller attentivement l'apparition de vapeur ou de vapeur.
- Pour maintenir la lame à la température désirée pendant 5 minutes complètes, appliquez de la chaleur par intermittence.
- Veillez à ne pas faire bouillir, brûler ou sécher complètement votre frottis taché.
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Rincez la lame à l'eau froide. Laisser la lame refroidir pendant environ 5 minutes, puis rincer très doucement pendant quelques secondes avec de l'eau propre provenant d'un robinet ou d'un flacon souple pour éliminer toute tache qui n'est pas liée à l'échantillon.
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Couvrir le frottis avec de l'alcool acide ou de l'acide sulfurique. Ajouter suffisamment d'alcool acide à 3% volume sur volume (v / v) ou 20% d'acide sulfurique pour recouvrir complètement le frottis. Laissez l'acide sur la lame jusqu'à ce que la tache soit devenue rose très pâle. Cela prend généralement au moins 10 minutes.
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Rincez la lame à l'eau claire. Rincer doucement avec de l'eau du robinet ou du flacon souple, en veillant à éliminer tout l'acide et toute trace de colorant restante.
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Ajoutez du contre-colorant à la diapositive. Une fois la lame rincée, couvrez votre tache avec une solution de vert malachite ou de bleu de méthylène de Loeffler. Ces solutions créent un «arrière-plan» vert ou bleu qui aide les bactéries teintes en rouge à se démarquer et tache également tout autre matériel biologique sur la lame (comme les cellules humaines et les bactéries qui ne sont pas acido-résistantes). Laissez la tache reposer pendant 1 à 2 minutes.
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Rincez et séchez la lame. Lavez doucement la lame à l'eau claire pour éliminer tout excès de contre-colorant. Lorsque vous avez terminé, essuyez l'arrière de la diapositive avec un chiffon propre et placez la diapositive sur une grille pour qu'elle sèche à l'air.
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Examinez la lame au microscope à un grossissement de 1000x. Les bactéries acido-résistantes doivent apparaître en rouge ou en rose vif. Les bactéries non acido-résistantes, les cellules non bactériennes et l'arrière-plan apparaîtront en bleu ou en vert.

La coloration de Gram est une procédure qui vous permet de diviser les bactéries en 2 types courants: Gram positif et Gram négatif.

Méthode 3 sur 4: observation de l'apparence et du comportement des bactéries

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Observez la forme des bactéries. Une fois que vous avez utilisé la coloration pour déterminer si vos bactéries sont Gram positives, Gram négatives ou acido-résistantes, il est temps de restreindre le type de bactéries. La première étape consiste à observer la ou les formes des bactéries sur la lame. Les 3 formes les plus courantes sont le coccus (sphérique), le bacille (en forme de bâtonnet) et la spirale.
- Il existe de nombreuses variantes sur toutes ces formes. Par exemple, les bactéries coccus peuvent apparaître dans diverses formations, telles que des paires fusionnées (diplococcus), des chaînes, des grappes ou des groupes de 4 (tétrades).
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Déterminez si les bactéries sont aérobies ou anaérobies. Prélevez 2 échantillons de bactéries et créez 2 cultures séparées. Une culture doit être anaérobie (cultivée sans oxygène) et l'autre doit être aérobie (cultivée avec de l'oxygène). Conservez votre culture anaérobie dans un environnement sans oxygène à 35°C pendant au moins 48 heures avant d'essayer d'observer la croissance bactérienne.
- Si vos bactéries se développent dans un environnement sans oxygène, mais pas lorsqu'elles sont exposées à l'oxygène, elles sont anaérobies.
- Les bactéries qui se développent lorsqu'elles sont exposées à l'oxygène, mais pas lorsqu'elles sont conservées dans un environnement sans oxygène, sont aérobies.
- Les bactéries qui peuvent se développer dans les deux environnements sont appelées anaérobies facultatifs.
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Faites un test de motilité pour savoir si vos bactéries sont mobiles. Les bactéries mobiles peuvent se déplacer d'elles-mêmes en utilisant un ou plusieurs flagelles pour se propulser. La motilité, ou le manque de motilité, peut être un facteur important dans l'identification d'une souche de bactérie. Il existe plusieurs types de tests de motilité, mais le test de milieu semi-solide est le plus sûr et le plus facile à lire.
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Créez une culture pour votre test de motilité. Préparez une culture de bactéries dans un bouillon nutritif. Préparez le bouillon selon les instructions de votre milieu de bouillon préféré.
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Inoculer un tube de gélose de motilité semi-solide avec votre culture. Enduire une aiguille d'inoculation stérile avec une partie du bouillon de culture. Piquez soigneusement l'aiguille directement dans un tube de gélose semi-solide formulé pour les tests de motilité (comme la gélose TTC). L'aiguille doit aller à environ 0,67 du chemin dans la gélose.
- Lorsque vous avez terminé, retirez soigneusement l'aiguille, en prenant soin de ne pas casser la «ligne de coup de couteau» d'origine.
- Incuber le tube à 30°C pendant 48 heures.
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Lisez les résultats du test de motilité. La gélose de motilité devient rouge lorsqu'elle entre en contact avec des bactéries. Si vos bactéries sont mobiles, une couleur rouge ou rose sera diffusée dans toute la gélose. S'ils ne sont pas mobiles, vous ne verrez que la couleur rouge le long de la ligne de coup de couteau d'origine.

Lisez aussi: Comment dessiner un polygone?

Méthode 4 sur 4: tout rassembler

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Rassemblez vos observations. Pour affiner le genre de bactéries, vous devrez combiner les informations de vos colorations, cultures et observations de la forme bactérienne. Si vous testez une culture d'un patient, des informations sur ses symptômes peuvent également être utiles pour restreindre le champ.
- Par exemple, si vos tests révèlent que vos bactéries sont des bacilles à Gram négatif, anaérobies et non mobiles, et qu'elles sont associées à des douleurs abdominales, des nausées et des vomissements chez le patient, il s'agit probablement de Bacteroides fragilis.
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Consultez une base de données de bactéries. Puisqu'il y a tellement d'espèces de bactéries, il est impossible de se souvenir ou de les reconnaître toutes par vous-même. Vous devrez probablement consulter un manuel de microbiologie clinique ou une base de données en ligne et rechercher des bactéries présentant toutes les caractéristiques de votre échantillon.
- Les bonnes ressources en ligne pour identifier les bactéries comprennent le Centre d'intégration des ressources Pathosystems (patricbrc.org) et la base de données sur les bactéries pathogènes à GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
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Utilisez des tests génétiques pour déterminer les espèces exactes de bactéries. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'identifier les espèces exactes de bactéries. Le moyen le plus rapide et le plus efficace de le faire est de faire des tests ADN. Les tests ADN sont également utiles pour identifier les bactéries qui résistent aux formes traditionnelles de culture ou de coloration. Les tests ADN microbiens modernes peuvent être effectués très rapidement, parfois en aussi peu que 2 heures.
- Si vous n'avez pas accès à un laboratoire qui effectue le séquençage du génome microbien, envoyez un échantillon à un établissement spécialisé, tel que MIDI Labs ou CD Genomics.

Les bactéries acido-résistantes contiennent une plus grande quantité de lipides que les autres types de bactéries, ce qui les rend résistantes aux agents colorants utilisés dans la coloration de Gram.

Mises en garde

Utilisez toujours des précautions de sécurité lorsque vous travaillez avec des échantillons microbiens et des réactifs de coloration. Si vous vous sentez mal après avoir travaillé avec des échantillons de bactéries, consultez immédiatement un médecin.
Ces procédures doivent toujours être effectuées dans un laboratoire de microbiologie avec un équipement en bon état de fonctionnement.

Les choses dont vous aurez besoin

Identifier les bactéries avec coloration Gram

Échantillons bactériens
Lunettes de sécurité
Gants en nitrile
Blouse de laboratoire
Lames de microscope
Égouttoir à glissière
bec Bunsen
Lampe à alcool ou chauffe-glissière électrique
Pince à linge
Bouteille d'eau
Solution de violet de cristal de gramme
Solution d'iode Gram
Solution d'éthanol ou d'acétone
Solution de Gram safranine
Microscope capable d'un grossissement de 1000X

Une fois que vous avez utilisé la coloration pour déterminer si vos bactéries sont Gram positives, Gram négatives ou acido-résistantes, il est temps de restreindre le type de bactéries.

Utilisation de la technique de coloration de ziehl-neelsen

Échantillons bactériens
Lunettes de sécurité
Gants en nitrile
Blouse de laboratoire
Lames de microscope
Égouttoir à glissière
bec Bunsen
Lampe à alcool ou chauffe-glissière électrique
Bouteille d'eau
Hotte
Solution de carbol-fuchsine
20% d'acide sulfurique ou 3% v / v d'alcool acide
Solution de vert de malachite ou de bleu de méthylène de Loeffler
Microscope capable d'un grossissement de 1000X

Observer l'apparence et le comportement des bactéries

Microscope capable d'un grossissement de 1000X
Cultures bactériennes aérobies et anaérobies
Bouillon nutritif moyen
Gélose semi-solide de motilité
Aiguille d'inoculation