Comment effectuer une chromatographie liquide haute performance (HPLC)?
Utilisez une phase mobile telle que le méthanol-eau ou l'acéto-nitrite pour la HPLC en phase inverse. Utilisez une phase mobile telle que l'alcool-heptane ou le chloroforme-heptane pour la HPLC en phase normale..
Les pharmaciens et les chimistes rencontrent de nombreux mélanges organiques naturels et des mélanges de réactions chimiques dans leur travail. En tant que tel, un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC) est l'un des instruments les plus essentiels pour tout laboratoire. Un instrument HPLC permet de séparer et d'analyser ces mélanges (quantitativement et qualitativement). Dans ce type de chromatographie sur colonne, la granulométrie de la phase stationnaire est suffisamment petite pour que le solvant la traverse difficilement; pour surmonter cela, une haute pression de 3000 à 5000 psi est appliquée. C'est la technique la plus sensible, la plus efficace et la plus précise.
- 1Suivez les règles et les règlements et portez votre tablier.
- Nettoyez la HPLC.
- Allumez-le et attendez qu'il démarre.
- Préparer l'instrument pour l'analyse.
- Conservez le(s) solvant(s) dans la phase mobile dans un réservoir de solvant ou un plateau de solvant. Le solvant est utilisé pour séparer les composants du mélange. Dans les instruments modernes, le mélange de solvants peut être utilisé comme phase mobile appelée élution par gradient. L'élution est la séparation en composants.
- Utilisez du méthanol-eau ou du chloroforme-heptane, etc. comme solvant.
- 2Sélectionnez les types de HPLC en fonction de la polarité relative des phases:
- Phase normale: utilisez une phase stationnaire polaire comparée à la phase mobile si vous effectuez une HPLC en phase normale.
- HPLC en phase inversée: utilisez une phase stationnaire moins polaire par rapport à la phase mobile. En général, la phase inverse est utilisée.
- 3Introduisez les données dans le système ou programmez le HPLC.
- Attribuez le numéro aux solvants lorsque vous optez pour l'élution par gradient.
- Spécifiez le débit.
- Régler la pression de la pompe.
- 4Analysez votre échantillon.
- Ajoutez votre échantillon dans le système d'injection. C'est le mécanisme qui introduit l'échantillon (le mélange à séparer) dans le système.
- Chargez la phase stationnaire dans la colonne.
- Démarrez la HPLC en cliquant sur le bouton Démarrer sur l'écran de l'ordinateur qui lui est connecté.
- Attendez un certain temps pour la séparation du mélange en composants. Le temps de rétention est le temps mis par le solvant pour séparer les composants, qui est égal au temps où vous entrez le mélange dans la colonne jusqu'au moment où il est détecté/analysé.
- 5Développez vos composants. Attendez que votre mélange soit séparé en ses composants. C'est ce qu'on appelle le développement, lorsque le contenu de l'échantillon sera détecté par le détecteur.
- 6Observez le résultat. Regardez la séparation des composants détectés et enregistrés sur le graphique. Il y aura différents pics correspondant aux composants et à leur concentration.
- 7Appliquez vos découvertes à votre travail. Il existe de nombreuses utilisations de la HPLC en pharmacie, en chimie et dans des industries telles que la production alimentaire. Certaines des applications importantes suivent.
- Utilisez-le pour une analyse qualitative en comparant le temps de rétention observé dans des conditions identiques.
- Utilisez la HPLC pour l'analyse quantitative, comme l'évaluation de la concentration des composants.
- Analyser la séparation des lipides.
- Utilisez-le pour les réponses dans le travail médico-légal sur les affaires criminelles/poison.
En HPLC liquide-liquide, la phase stationnaire et la phase mobile ne doivent pas être miscibles.
- Utilisez une phase mobile telle que le méthanol-eau ou l'acéto-nitrite pour la HPLC en phase inverse.
- Utilisez une phase mobile telle que l'alcool-heptane ou le chloroforme-heptane pour la HPLC en phase normale.
- Soyez prudent lorsque vous insérez les données dans le système; de petites erreurs changeront totalement le résultat.
- Après chaque analyse, exécutez le méthanol comme phase mobile pour laver et rincer la HPLC avant une autre analyse.
- En HPLC liquide-liquide, la phase stationnaire et la phase mobile ne doivent pas être miscibles.
- Avant de quitter le laboratoire, assurez-vous d'éteindre la HPLC.
- Échantillon (extrait/mélange organique naturel)
- Phase mobile
- État stationnaire
- Appareil HPLC
- Méthanol
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Questions et réponses
- Pourquoi applique-t-on autant de pression élevée?Parce que la taille des particules de la phase stationnaire est petite et qu'il est difficile pour la phase mobile de la traverser. Pour surmonter cela, une pression élevée est appliquée.
Les commentaires (4)
- J'ai pris connaissance de son mode opératoire.
- Très utile. J'en avais besoin.
- Je connaissais déjà la méthodologie et la technique mais les astuces sont bien plus utiles.
- Pas de commentaires, extraordinaire a expliqué comment effectuer. Merci.
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